Is-sekwenzi ġenomiċi tal-biċċa l-kbira tal-virusijiet ġew magħrufa.Sondi ta ' l - aċidu nuklejku li huma segmenti qosra ta ' DNA ddisinjati biex ibridizzaw ma ' segmenti ta ' DNA virali jew RNA komplementari .Ir-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) hija teknika aktar effiċjenti għall-iskoperta virali.Metodi dijanjostiċi ta' throughput għoli ġew żviluppati reċentement.
A. Teknika ta 'ibridizzazzjoni ta' aċidu nuklejku
L-ibridizzazzjoni tal-aċidu nukleiku, prinċipalment inklużi Southern blotting(Southern) u Northern blotting(Northern), hija teknika ġdida li qed tiżviluppa malajr fil-qasam dijanjostiku tal-virus.Ir-raġunament tal-assaġġ ta 'ibridizzazzjoni huwa li jintużaw segmenti qosra ta' DNA (imsejħa "sonda") iddisinjati biex ibridizzaw ma 'segmenti ta' DNA virali jew RNA komplementari.Permezz ta 'tisħin jew trattament alkalin, id-DNA jew l-RNA ta' mira b'linja doppja huma separati fi linji singoli u mbagħad jiġu immobilizzati fuq appoġġ solidu.Wara dan, is-sonda hija miżjuda u ibridata mad-DNA jew RNA fil-mira.Peress li s-sonda hija ttikkettjata b'isotopi jew nuklide mhux radjoattiv, id-DNA jew l-RNA fil-mira jistgħu jiġu skoperti permezz ta' awtoradjografija jew bis-sistema bijotina-avidin.Peress li l-biċċa l-kbira tal-ġenomi virali ġew ikklonati u sekwenzati, jistgħu jiġu skoperti bl-użu ta 'sekwenzi speċifiċi għall-virus bħala sondi fil-kampjun.Bħalissa, il-metodi ta 'ibridizzazzjoni jinkludu: dot blot, ibridizzazzjoni in situ fiċ-ċelloli, DNA blotting (DNA) (Southern blot) u RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR Teknoloġija
F'dawn l-aħħar snin, ġiet żviluppata serje ta 'tekniki ta' amplifikazzjoni ta 'aċidu nuklejku in vitro ibbażati fuq PCR, biex jiġu ttestjati virus insensittivi jew mhux kultivati.Il-PCR huwa metodu li jista' jissinteżi sekwenza speċifika tad-DNA permezz ta' reazzjoni tal-polimerażi in vitro.Il-proċess ta 'PCR jinkludi ċiklu termali ta' tliet passi: denaturazzjoni, ittemprar, u estensjoni F'temperatura għolja (93℃ ~ 95℃), id-DNA b'żewġ linji hija separata f'żewġ linji tad-DNA singolu;imbagħad f'temperatura baxxa (37 ℃ ~ 60 ℃), żewġ primers nukleotidi sintetizzati jannaw mas-segmenti tad-DNA komplementari;billi fit-temperatura xierqa għall-enzima Taq (72℃), is-sinteżi ta' ktajjen tad-DNA ġodda tibda mill-primer 3'end billi tuża DNA komplementari bħala mudelli u nukleotidi singoli bħala materjali.Allura wara kull ċiklu, katina waħda tad-DNA tista 'tiġi amplifikata f'żewġ ktajjen.Ir-repetizzjoni ta 'dan il-proċess, kull katina tad-DNA sintetizzata f'ċiklu wieħed tista' tintuża bħala mudell fiċ-ċiklu li jmiss, u n-numru ta 'ktajjen tad-DNA jiġi rduppjat f'kull ċiklu, li jfisser li l-produzzjoni tal-PCR hija amplifikata f'veloċità log 2n.Wara 25 sa 30 ċiklu, il-produzzjoni tal-PCR hija identifikata permezz tal-elettroforeżi, u l-prodotti speċifiċi tad-DNA jistgħu jiġu osservati taħt dawl UV (254nm).Għall-vantaġġ tiegħu ta 'speċiċità, sensittività u konvenjenza, PCR ġie adottat fid-dijanjosi klinika ta' ħafna infezzjonijiet virali bħal HCV, HIV, CMV, u HPV.Peress li l-PCR hija sensittiva ħafna, tista' tiskopri DNA tal-virus fil-livell fg, l-operazzjoni għandha titwettaq b'attenzjoni kbira biex tevita pożittiv falz.Barra minn hekk, riżultat pożittiv fit-test tal-aċidu nuklejku ma jfissirx li hemm virus infettiv ħaj fil-kampjun.
B'applikazzjoni wiesgħa ta 'teknika PCR, tekniki u metodi ġodda huma żviluppati bbażati fuq teknika PCR għal skopijiet ta' test differenti.Pereżempju, il-PCR kwantitattiv f'ħin reali jista' jiskopri tagħbija virali;PCR in situ tintuża biex tidentifika l-infezzjoni tal-virus fit-tessuti jew ċelloli;Il-PCR nested jista 'jżid l-ispeċifiċità tal-PCR.Fosthom, PCR kwantitattiv f'ħin reali ġie żviluppat aktar malajr.Ħafna tekniki ġodda, bħal sonda ta 'idroliżi TaqMan, sonda ta' ibridizzazzjoni, u sonda beacon molekulari, ġew magħquda f'teknika PCR kwantitattiva f'ħin reali, li hija utilizzata ħafna fir-riċerka klinika.Minbarra li tidentifika t-tagħbija virali fil-fluwidu tal-ġisem tal-pazjenti b'mod preċiż, dan il-metodu jista 'jintuża wkoll biex jinstab mutant tolleranti għall-mediċina.Għalhekk, PCR kwantitattiv f'ħin reali hija applikata prinċipalment fl-evalwazzjoni tal-effett kurattiv u s-sorveljanza tat-tolleranza tad-droga.
C. Sejbien ta 'rendiment għoli ta' aċidi nuklejċi virali
Biex jintlaħqu l-ħtiġijiet għal dijanjosi mgħaġġla ta 'mard infettiv emerġenti ġdid, ġew stabbiliti diversi metodi ta' sejbien ta 'rendiment għoli, bħal ċipep tad-DNA (DNA).Għal ċipep tad-DNA, sondi speċifiċi huma sintetizzati u mwaħħla ma 'ċipep tas-silikon żgħar f'densità għolja ħafna biex jiffurmaw DNA probe microarray (DNA) li jista' jiġi ibridizzat mal-kampjun.Is-sinjal ta 'ibridizzazzjoni jista' jiġi immaġni b'mikroskopju konfokali jew scanner tal-lejżer u jiġi pproċessat aktar mill-kompjuter u jista 'jinkiseb sett ta' dejta enormi dwar ġeni differenti.Hemm żewġ tipi ta 'ċippa tad-DNA.Iċ-"ċippa ta 'sinteżi" hija kif ġej: l-oligonukleotidi speċifiċi huma sintetizzati direttament fuq iċ-ċipep.Ieħor huwa DNA pool chip.Il-ġeni kklonati jew il-prodotti tal-PCR huma stampati b'mod ordnat fuq il-pjastra.Il-vantaġġ tat-teknoloġija taċ-ċippa tad-DNA huwa l-iskoperta simultanja ta 'kwantità kbira ta' sekwenzi tad-DNA.L-aħħar verżjoni taċ-ċippa għall-iskoperta tal-patoġeni tista 'tidentifika aktar minn 1700 virus uman f'daqqa.It-teknoloġija taċ-ċippa tad-DNA solviet il-problemi tal-metodi tradizzjonali ta 'ibridizzazzjoni tal-aċidu nuklejku u għandha applikazzjonijiet wesgħin ħafna fid-dijanjosi virali u l-istudju epidemjoloġiku.
Ħin tal-post: Diċ-23-2020